一.分子克隆
1. 转化涂板后第二天菌落长得太密，无法挑取单克隆？
细菌在摇床中活化时间不要太长，控制在30~60min，涂板时减少菌液用量，尽量涂布均匀。
2. 载体构建，胶回收DNA-漂洗液为什么加乙醇？
用无水乙醇沉淀DNA，实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。
3. 提取质粒过程中有哪些步骤可以提高质粒回收效率？
（1）完全晾干管内外壁的乙醇；
（2）用于洗脱质粒的EB或水，在使用前将其放入65~70℃的水浴锅中水浴；
（3）第一遍洗脱DNA收集到的EB或水再次加到吸附柱中并离心，以充分洗脱DNA；
（4）实验结束后尽快将质粒放入冰箱保存，防止降解。
4. 酶切后回收的DNA片段连接为什么效率低？
原因：
（1）载体以及PCR产物没有酶切完全；
（2）连接酶失效；
（3）感受态效率低，转化操作不当。
解决方法：
（1）选酶切位点时，不要选取距离较近的；另外引物设计时，酶切位点两端加上保护碱基，并适当延长酶切时间；
（2）做转化时，设置空白对照及阳性对照，排除操作上的影响。
5. PCR实验出现非特异性扩增的原因及解决方法。
原因：引物特异性差；模板或者引物的浓度过高；酶的使用过量；Mg2+的浓度过高；退火温度偏低；循环次数过多。
对策：重新设计合成新的引物或者采用巢式PCR；降低模板或者引物的浓度；减少酶的使用量；降低镁离子的浓度；适当提高退火温度；减少反应循环的次数。
6. PCR出现拖尾的原因及解决方法。
原因：模板纯度不高；退火温度偏低；循环次数多；酶的使用过量。
对策：纯化模板；适当提高退火温度；降低循环次数；减少酶的用量。
7. qPCR (SYBR Green法) Ct值过大的原因
原因：扩增效率较低；PCR产物太长。
对策：优化反应条件，如改三步法或者降低退火温度；产物长度一般在80～200bp较为合适。
8. qPCR实验结果中无Ct值出现的原因。
原因：
（1）检测荧光信号的步骤有误；
（2）引物或探针降解；
（3）模板量不足或降解。
解决方法：
（1）一般SG法采用 72℃延伸时采集信号，Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集；
（2）可通过电泳检测其完整性；
（3）对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
（4）避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
