一.分子克隆

1. 转化涂板后第二天菌落长得太密,无法挑单克隆?

细菌在摇床中活化时间不要太长,控制在30~60min,涂板时减少菌液用量,尽量涂布均匀。

2. 载体构建,胶回收DNA-漂洗液为什么加乙醇?

用无水乙醇沉淀DNA,实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合。

3. 质粒过程中有哪些步骤可以提高质粒回收效率?

1)完全晾干管内外壁的乙醇

2)用于洗脱质粒的EB或水,在使用前将其放入65~70℃的水浴锅中水浴

3)第一遍洗脱DNA收集到的EB或水再次加到吸附柱中并离心,以充分洗脱DNA

4实验结束后尽快质粒放入冰箱保存,防止降解。

4. 酶切后回收的DNA片段连接为什么效率低

原因:

1)载体以及PCR产物没有酶切完全

2)连接酶失效

3)感受态效率低,转化操作不当

解决方法:

1)选酶切位点时,不要选取距离较近的另外引物设计时,酶切位点两端加上保护碱基,并适当延长酶切时间

2)做转化时,设置空白对照及阳性对照,排除操作上的影响。

5.  PCR实验出现非特异性扩增的原因及解决方法。

原因:引物特异性差;模板或者引物的浓度过高;酶的使用过量;Mg2+的浓度过高;退火温度偏低;循环次数过多。

对策:重新设计合成新的引物或者采用巢式PCR;降低模板或者引物的浓度;减少酶的使用量;降低镁离子的浓度;适当提高退火温度;减少反应循环的次数。

6. PCR出现拖尾的原因及解决方法。

原因:模板纯度不高;退火温度偏低;循环次数多;酶的使用过量。

对策:纯化模板;适当提高退火温度;降低循环次数;减少酶的用量。

7. qPCR (SYBR Green) Ct值过大的原因

原因:扩增效率较低PCR产物太长。

对策:优化反应条件,如改三步法或者降低退火温度产物长度一般在80200bp较为合适。

8. qPCR实验结果中无Ct值出现的原因
原因:

1)检测荧光信号的步骤有误

2)引物或探针降解

3)模板量不足降解

解决方法:

1)一般SG法采用 72℃延伸时采集信号,Taqman 法则一般在退火结束时或延伸结束采集
2)可通过电泳检测其完整性
3)对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起
4)避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。


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