三.细胞转染

1. 质粒转染24 h后荧光强度不高的原因。

瞬时转染时一般细胞转染荧光蛋白24 h后,就能发出荧光,48~72 h荧光强度会增强,72 h后会逐渐衰落。24 h后荧光强度不强可选择观察48 h72 h的结果。如果还不是很理想,考虑更换效率更高的转染试剂和重新提取高质量的质粒

2进行常规转染有哪些注意事项?

1)转染前一天铺板,转染当日细胞密度以70-90%为宜

2)用于转染的质粒必须纯净无污染,无内毒素

3)转染前可以换一次新鲜的培养液

4)准备质粒DNA和转染试剂稀释液时要使用无血清培养基

5)阳离子脂质体试剂会增加细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这会降低细胞的活性,导致转染效率降低,细胞毒性增大

6)注意设置阳性对照和阴性对照。

3. PEI,脂质体转染以及电转的区别?

1)阳离子脂质体转染法:带正电荷的脂质体靠静电作用和DNA结合形成DNA-脂质体复合物,然后通过细胞的内吞作用进入细胞。主要特点是操作简便,适用于各种裸露DNARNA片段,适合转染各种细胞,对DNA浓度有一定的要求,对细胞有一定毒性

2PEI:带正电的阳离子聚合物与核酸的磷酸基团形成带正电的复合物,复合物和带负电的细胞膜接触,通过内吞作用进入细胞。主要特点是毒性较低,操作简单,适用性广

3)电转:高脉冲的电压破坏细胞膜,在细胞膜表面形成孔道,DNA通过孔道进入细胞。主要特点是适用性广,适用于质粒和非常大的基因组片段,细胞致死率高。

4. 细胞转染效率较低的原因?

原因:

1)选择的转染试剂不合适;

(2)细胞状态不佳;

(3)质粒浓度较高或者较低;

(4)细胞铺板密度过大

(5)转染试剂用量太大,对细胞有毒性。

解决方法:

1)对不同的细胞选取最合适的转染试剂;

2)确保提取的质粒浓度合适并且特异性好,提完质粒可进行琼脂糖凝胶电泳验证;

3)对于不同的转染试剂,要进行用量的浓度梯度摸索,选取转染效率最高的浓度进行后续实验;

4)细胞应在贴壁并且融合度达到70%左右进行转染。



[营业执照]   版权所有Copyright © 2019-2021 河南普诺易生物制品研究院有限公司

客户服务热线

0373-2058988

17737369691

19836237919

在线客服