六.蛋白纯化有关问题

1. 纯化蛋白过程中如何防止蛋白质降解?

1)使用蛋白酶抑制剂:破碎细胞提取蛋白质的同时可释放蛋白酶,这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解

2)低温:低温进行避免蛋白的降解和变性。比如,纯化在4层析柜中;离心选择低温离心机;其余操作在冰上进行,操作中切勿碰到离心管底部有蛋白部分

3Buffer的选择:不同pH值,离子的浓度对蛋白有影响,根据纯化的蛋白来做相应的调整

4)蛋白储存:浓缩纯化后的蛋白质尽量以高浓度保存,浓度最好在1mg/ml以上,高浓度更有利于蛋白质的稳定。分装纯化后的蛋白质,进行分装保存,避免反复冻融或冻干重溶解过程,这样很可能会降低生物活性。速冻/速融在蛋白质溶液冷冻的过程中,纯水首先结冰,蛋白质分子会被暴露在极高的盐浓度或pH下,会破坏蛋白的活性。因此,需要尽可能缩短冷冻的过程。速冻可以在液氮中进行,然后将蛋白质保存在-20-80中。

2. 蛋白分离纯化过程中的注意事项

由于蛋白质只有在其天然结构状态下具有活性,具备相应的功能。因此,在进行任何一种蛋白质纯化的时候,都要时刻注意维护它的稳定性,保护它的活性,无论进行何种层析,都需要注意以下方面:

1)生产过程中考虑操作温度,尤其是目的蛋白稳定性较差的样品,最好置于冰上或者在冷库内进行操作;即使是对温度不敏感的样品,也应控制操作温度不超过室温,温度过高会导致蛋白缓慢变性;

2)样品浓度要控制在一定范围内

3)选用合适pH的缓冲液,所使用的缓冲溶液pH避免与蛋白质等电点相同,防止蛋白质的沉淀

4)避免样品反复冻融和剧烈搅动,以防蛋白质的变性

5)纯化用缓冲溶液的温度尽量控制稳定,温度过低则容易导致层析过程中产生气泡,温度过高则容易使蛋白质变性

6)尽量保证各步分离纯化过程紧密相连,减少样品放置时间,因纯化过程为非无菌过程,如拖延时间过长,会导致样品中菌量增加,进而导致样品内毒素水平急剧升高。


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