六.蛋白纯化有关问题

1. 纯化蛋白过程中如何防止蛋白质降解？

（1）使用蛋白酶抑制剂：破碎细胞提取蛋白质的同时可释放蛋白酶，这些蛋白酶需要迅速的被抑制以保持蛋白质不被降解；

（2）低温：低温进行避免蛋白的降解和变性。比如，纯化在4℃层析柜中；离心选择低温离心机；其余操作在冰上进行，操作中切勿碰到离心管底部有蛋白部分；

（3）Buffer的选择：不同pH值，离子的浓度对蛋白有影响，根据纯化的蛋白来做相应的调整；

（4）蛋白储存：①浓缩：纯化后的蛋白质尽量以高浓度保存，浓度最好在1mg/ml以上，高浓度更有利于蛋白质的稳定。②分装：纯化后的蛋白质，进行分装保存，避免反复冻融或冻干重溶解过程，这样很可能会降低生物活性。③速冻/速融：在蛋白质溶液冷冻的过程中，纯水首先结冰，蛋白质分子会被暴露在极高的盐浓度或pH下，会破坏蛋白的活性。因此，需要尽可能缩短冷冻的过程。速冻可以在液氮中进行，然后将蛋白质保存在-20℃或-80℃中。

2. 蛋白分离纯化过程中的注意事项

由于蛋白质只有在其天然结构状态下具有活性，具备相应的功能。因此，在进行任何一种蛋白质纯化的时候，都要时刻注意维护它的稳定性，保护它的活性，无论进行何种层析，都需要注意以下方面：

（1）生产过程中考虑操作温度，尤其是目的蛋白稳定性较差的样品，最好置于冰上或者在冷库内进行操作；即使是对温度不敏感的样品，也应控制操作温度不超过室温，温度过高会导致蛋白缓慢变性;

（2）样品浓度要控制在一定范围内；

（3）选用合适pH的缓冲液，所使用的缓冲溶液pH避免与蛋白质等电点相同，防止蛋白质的沉淀；

（4）避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性；

（5）纯化用缓冲溶液的温度尽量控制稳定，温度过低则容易导致层析过程中产生气泡，温度过高则容易使蛋白质变性；

（6）尽量保证各步分离纯化过程紧密相连，减少样品放置时间，因纯化过程为非无菌过程，如拖延时间过长，会导致样品中菌量增加，进而导致样品内毒素水平急剧升高。