DH10Bac感受态细胞

货号:CC1004    

规格100 μL×10

产品简介:

DH10Bac菌株主要用于生产重组杆状病毒分子(Bac-to-Bac杆状病毒表达系统)。该菌株中含有父本杆粒bMON14272、辅助质粒pMON7124:父本杆粒bMON14272包含mini-F复制子,卡那抗性基因,attTn7位点和lacZα互补因子;辅助质粒pMON7124含有tnsABCD区(tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid),具有四环素抗性,在细胞扩增过程中丢失,但可提高供体质粒pFastBac(具有庆大霉素抗性)转化后的基因转座效率。mcrAmcrBCmrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNATherefore, genomic DNA, both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac)。recA1endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选,DH10Bac感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μg DNA

基因型:F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZM15 lacX74 recA1 endA1 araD139 (ara, leu)7697 galU galK λ-rpsLnupG/pMON14272/pMON7124

保存条件:

-80℃保存,一年有效。

使用说明:(以下操作均按无菌条件的标准进行)

供体质粒(pFastBac等)转化重组方法:

1. DH10Bac感受态细胞从-80℃拿出,迅速插入冰中,5分钟后待菌块融化,加入供体质粒(pFastBac等)1ng,并用手拨打EP管底混匀,冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒,迅速放回冰中并静置2分钟,晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入900 μl不含抗生素的SOC液体培养基,37℃225 rpm复苏4小时。

4. 复苏完成后,用SOC稀释转化液到(10-110-2),每个稀释用吸取100 ul铺一个LB平板(共涂3个平板),平板包含50 μg/mL Kan7 μg/mL Gentamicin7 μg/mL tetracycline40 μg/mL X-gal40 μg/mL IPTG

5. 将平板倒置放于37℃培养箱48小时(抗生素含量较高,需在37度长时间培养才能挑到合适克隆)。

阳性验证:

1. 10个白色的克隆,重新划线在LB平板(50 μg/mL Kan7 μg/mL Gentamicin7 μg/mL tetracycline40 μg/mL X-gal40 μg/mL IPTG)。37度过夜培养。

2. 挑选白色的克隆,转接到含有50 μg/mL Kan7 μg/mL Gentamicin7 μg/mL tetracyclineLB培养液中,过夜培养。

3. 使用试剂盒(或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA>100 kb)。使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。

注意事项:

1. 感受态细胞应保存在-80℃,不可反复冻融,否则其转化效率将会降低。

2. 实验过程中应严格无菌操作,防止其它DNA或杂菌的污染,避免为以后的筛选、鉴定带来影响。

3. 转化时,转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。


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