三.细胞转染

1. 质粒转染24 h后荧光强度不高的原因。

瞬时转染时，一般细胞转染荧光蛋白24 h后，就能发出荧光，48~72 h荧光强度会增强，72 h后会逐渐衰落。24 h后荧光强度不强可选择观察48 h和72 h的结果。如果还不是很理想，考虑更换效率更高的转染试剂和重新提取高质量的质粒。

2. 进行常规转染有哪些注意事项？

（1）转染前一天铺板，转染当日细胞密度以70-90%为宜；

（2）用于转染的质粒必须纯净无污染，无内毒素；

（3）转染前可以换一次新鲜的培养液；

（4）准备质粒DNA和转染试剂稀释液时要使用无血清培养基；

（5）阳离子脂质体试剂会增加细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这会降低细胞的活性，导致转染效率降低，细胞毒性增大；

（6）注意设置阳性对照和阴性对照。

3. PEI，脂质体转染以及电转的区别?

（1）阳离子脂质体转染法：带正电荷的脂质体靠静电作用和DNA结合形成DNA-脂质体复合物，然后通过细胞的内吞作用进入细胞。主要特点是操作简便，适用于各种裸露DNA和RNA片段，适合转染各种细胞，对DNA浓度有一定的要求，对细胞有一定毒性；

（2）PEI：带正电的阳离子聚合物与核酸的磷酸基团形成带正电的复合物，复合物和带负电的细胞膜接触，通过内吞作用进入细胞。主要特点是毒性较低，操作简单，适用性广；

（3）电转：高脉冲的电压破坏细胞膜，在细胞膜表面形成孔道，DNA通过孔道进入细胞。主要特点是适用性广，适用于质粒和非常大的基因组片段，细胞致死率高。

4. 细胞转染效率较低的原因？

原因：

（1）选择的转染试剂不合适；

（2）细胞状态不佳；

（3）质粒浓度较高或者较低；

（4）细胞铺板密度过大；

（5）转染试剂用量太大，对细胞有毒性。

解决方法：

（1）对不同的细胞选取最合适的转染试剂；

（2）确保提取的质粒浓度合适并且特异性好，提完质粒可进行琼脂糖凝胶电泳验证；

（3）对于不同的转染试剂，要进行用量的浓度梯度摸索，选取转染效率最高的浓度进行后续实验；

（4）细胞应在贴壁并且融合度达到70%左右进行转染。