1. 转膜时，电流、电压条件怎样选择？

视实际情况而定，转膜一般恒流比较好。转膜中热量产生很多，导致缓冲液挥发消耗，缓冲液成分变化。如恒压会导致电流不断改变，转膜过程不平稳。调节到恒流后，电压会变化，但是缓冲液中带电粒子运动稳定，有利于转出高质量的膜。一般小分子蛋白(50kDa以下)可以300mA 1.5h，大分子蛋白300mA 2.5h。

2. Western Blot如何根据分子量大小选择合适的胶？

一般来说，6%的胶，最佳分离范围50~150kDa；8%的胶，最佳分离范围30~90kDa；10%的胶，最佳分离范围20~80kDa；12%的胶，最佳分离范围12~60kDa；15%的胶，最佳分离范围10~40kDa。

3. Western Blot每条泳道中上样总蛋白多少合适？

同一组样本测过浓度以后，把所有样本的浓度都调整到和最低浓度的那个样本一样的浓度，上样量控制在20~30μg。

4. 做Western Blot时，为什么目的条带与预期不一致？

蛋白质印迹法是根据蛋白质的大小分离蛋白质的技术，一般来说，蛋白质越小，迁移越快。然而，迁移也受到其他因素的影响，因此观察到的实际条带大小可能与预测的不同。常见的因素包括翻译后修饰，如磷酸化、糖基化等，增加了蛋白质的大小。翻译后裂解，许多初合成的蛋白裂解成活性的形式，如亲半胱天冬酶剪接变异体，选择性剪接可以从同一基因中产生不同大小的蛋白质。相对电荷，氨基酸的组成（带电与非带电）如二聚蛋白多聚体。一般会出现分子量变小的情况，尽管强的相互作用会导致分子量更高的条带的出现。

5. 为什么Western Blot时，蛋白条带会跑偏？

原因：可能是加样的蛋白体积相差过大；配胶时未混匀。

解决方法：配胶过程中要充分混匀；上样体积不一致时，用Loading buffer补充。

6. Western Blot条带边缘为什么中出现白色圆圈？

出现白圈的原因是转膜过程中膜和胶中间存在气泡。解决方法是在转膜时注意排尽膜和胶之间的气泡。

7. 为什么Western Blot出现非特异性条带？

可能是一抗不纯或者特异性不高，一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，封闭不充分，洗膜时间和次数不够。优化的方式是降低抗体浓度，确保封闭的充分，使用质量有保障的抗体。

8. Western Blot条带背景脏的原因。

原因：

（1）一抗、二抗浓度过高；

（2）封闭液（牛奶）封闭时间较短或者牛奶溶解不充分；

（3）蛋白降解导致蛋白浓度过低；

（4）1×TBST洗涤不充分。

解决方法：

（1）提完蛋白尽早进行实验，提取的蛋白放在-80℃保存；

（2）封闭液提前配制，可进行超声溶解；

（3）一抗、二抗浓度进行稀释，选取合适的抗体浓度；

（4）增加1×TBST洗涤时间，并及时换新的1×TBST进行洗涤。

9. Western Blot时哪些因素会影响跑胶的质量？

（1）小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。一般来说，浓缩胶可以80V,分离胶100V；

（2）胶的均匀度，胶越均匀，分离越均匀。倒胶之前要充分混匀，玻璃板要洗干净；

（3）无水乙醇液封时，动作要轻柔，避免稀释上层的分离胶。