货号：CC1004    

规格：100 μL×10

产品简介：

DH10Bac菌株主要用于生产重组杆状病毒分子（Bac-to-Bac杆状病毒表达系统）。该菌株中含有父本杆粒bMON14272、辅助质粒pMON7124：父本杆粒bMON14272包含mini-F复制子，卡那抗性基因，attTn7位点和lacZα互补因子；辅助质粒pMON7124含有tnsABCD区（tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid），具有四环素抗性，在细胞扩增过程中丢失，但可提高供体质粒pFastBac（具有庆大霉素抗性）转化后的基因转座效率。mcrA、mcrBC及mrr突变使DH10Bac菌株适合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore, genomic DNA, both prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突变有利于插入DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。ϕ80lacZΔM15的存在使DH10Bac可用于蓝白斑筛选，DH10Bac感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率>108cfu/μg DNA。

基因型：F-mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 endA1 araD139 ∆(ara, leu)7697 galU galK λ-rpsLnupG/pMON14272/pMON7124

保存条件：

-80℃保存，一年有效。

使用说明：（以下操作均按无菌条件的标准进行）

供体质粒（pFastBac等）转化重组方法：

1. DH10Bac感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入供体质粒（pFastBac等）1ng，并用手拨打EP管底混匀，冰中静置25分钟。

2. 42℃水浴热激45秒，迅速放回冰中并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3. 向离心管中加入900 μl不含抗生素的SOC液体培养基，37℃，225 rpm复苏4小时。

4. 复苏完成后，用SOC稀释转化液到（10-1，10-2），每个稀释用吸取100 ul铺一个LB平板（共涂3个平板），平板包含50 μg/mL Kan、7 μg/mL Gentamicin、7 μg/mL tetracycline、40 μg/mL X-gal、40 μg/mL IPTG。

5. 将平板倒置放于37℃培养箱48小时（抗生素含量较高，需在37度长时间培养才能挑到合适克隆）。

阳性验证：

1. 挑10个白色的克隆，重新划线在LB平板（50 μg/mL Kan、7 μg/mL Gentamicin、7 μg/mL tetracycline、40 μg/mL X-gal、40 μg/mL IPTG）。37度过夜培养。

2. 挑选白色的克隆，转接到含有50 μg/mL Kan、7 μg/mL Gentamicin、7 μg/mL tetracycline的LB培养液中，过夜培养。

3. 使用试剂盒（或异丙醇-醋酸钠法抽提重组质粒DNA（>100 kb）。使用PCR法分析重组质粒是否正确重组。

注意事项：

1. 感受态细胞应保存在-80℃，不可反复冻融，否则其转化效率将会降低。

2. 实验过程中应严格无菌操作，防止其它DNA或杂菌的污染，避免为以后的筛选、鉴定带来影响。

3. 转化时，转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA量过多或体积过大反而会降低转化效率。转化时DNA体积要小于感受态细胞体积的十分之一。